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    hbv-dna定量知道嗎?實驗室需要HBV DNA定量檢測嗎?

    發布時間:2020-11-25 11:13:09
    作者:大醫一院檢驗科

    我國自1992年在新生兒開展乙肝疫苗普種已來,乙型肝炎病毒(HBV)所致新發感染已有明顯減少。但我國目前仍有約9300萬慢性HBV感染者,其中慢性乙型肝炎患者2000~3000萬,慢性HBV感染所致慢性乙型病毒性肝炎及其相關疾病仍是是我國主要的傳染性疾病。近年來,人們對慢性HBV感染的自然史有了更為深入的了解,隨著核苷(酸)類似物、長效干擾素等抗病毒藥物的臨床應用,使得慢性乙型肝炎抗病毒治療取得了明顯發展。慢性HBV感染分期及臨床抗病毒治療相關的病人基線評估、治療方案選擇、療效評價和預后判定等方面對乙型病毒性肝炎的實驗室檢測提出了新的要求。我國在乙型病毒性肝炎診斷試劑的研發近年來也取得了較大進步,但與國際一流診斷試劑相比仍有一定的差距。本文著重討論HBV DNA定量檢測在慢性HBV感染分期、臨床抗病毒治療中的應用及意義。并就我國在乙型病毒性肝炎診斷試劑的研發上所面臨著較大的挑戰進行了討論。


    一、慢性HBV感染


    HBV可引起急性或慢性感染。急性感染潛伏期1~4個月不等,是否有臨床癥狀與感染時年齡有關,兒童時期 (小于4歲) 臨床型感染的發生率<10%;而成人感染HBV后,臨床型感染占30%以上。急性乙型病毒性肝炎的臨床癥狀典型,輔以肝臟生化學檢查如血清丙氨酸氨基轉移酶 (ALT) 異常,或/和血清膽紅素升高,血清學檢測如HBsAg陽性、抗-HBc IgM陽性,結合病史即可明確診斷,HBV DNA檢測在急性乙肝診斷上無太大意義。急性HBV感染超過6個月或血清HBsAg、HBV DNA檢測持續陽性超過6個月即可診斷為慢性HBV感染。


    通過病原學、血清學、生化學、肝臟組織學檢測,結合感染史及臨床資料,可將慢性HBV感染分為4個階段:免疫耐受期、免疫清除期、非活動性乙肝表面抗原(HBsAg)攜帶狀態和再活動期。免疫耐受期 圍產期及幼兒期暴露所致HBV感染多有典型的免疫耐受期,而青少年及成人期暴露所致感染多無此期。盡管有較高病毒復制,但由于HBV并直接致細胞病變作用較弱,處于免疫耐受期者可持續數十年而無明顯肝臟疾病進展。免疫清除期 是宿主免疫系統通過攻擊感染HBV的肝細胞試圖清除感染的過程,包括T細胞分泌的非細胞毒性細胞因子的細胞內活性,以及特異性細胞毒T淋巴細胞 (Cytotoxiclymphocyte,CTL) 對感染肝細胞的溶解殺傷等。肝臟壞死性炎癥反應是此期的主要特征,可表現為ALT持續升高,也可有間歇升高。免疫清除期的持續時間及炎癥強度與患者將來發生肝硬化或肝癌的危險性密切相關。非活動性HBsAg攜帶狀態 隨著機體針對HBV感染的免疫反應,約有66%或更多的感染者會發生HBeAg血清轉換, ALT在正常范圍內,肝活檢無明顯的炎癥反應,但HBsAg持續陽性。非活動性HBsAg攜帶狀態是最為常見的慢性HBV感染狀態,我國大多數慢性HBV感染者屬非活動性HBsAg攜帶者。感染者可長期處于非活動性HBsAg攜帶狀態,當機體免疫力低下時或其它原因,非活動性HBsAg攜帶者可進入再活動期。無論是圍生 (產) 期和嬰幼兒時期,或是在青少年和成人期感染HBV者,在其非活動或低 (非) 復制期的HBV感染者中,都可有部分患者發生再活動。再活動期處于再活動期者肝臟有活動性炎癥反應,實驗室檢測ALT間歇升高、血清HBsAg持續陽性,臨床上多為HBeAg陰性慢性乙型肝炎,也有少數可出現HBeAg陽轉;或發生前C或C區啟動子變異,HBV再度活動,但HBeAg陰性,兩者均表現為活動性慢性乙型肝炎。值得注意的是部分HBeAg陽性慢性乙型肝炎患者不經非活動性HBsAg攜帶狀態而直接轉為HBeAg陰性慢性乙型肝炎。乙肝恢復期 每年約1%非活動性HBsAg攜帶者可自發性清除HBsAg,實驗室檢測血清HBsAg陰性,可有抗-HBc和抗-HBs抗體陽性,血清中檢測不到HBV DNA,稱為乙肝恢復(Resolved Hepatitis B),由于我國慢性HBV感染者多在嬰幼兒時期感染,自然發生乙肝恢復者較為少見。隱匿性HBV感染 (Occult HBV infection) 血清HBsAg檢測陰性,但外周血或肝組織中可檢測到HBV DNA。應注意隱匿性乙型病毒性肝炎的實驗室診斷。


    二、HBV DNA實驗室定量檢測的意義


    乙肝病毒在宿主肝細胞內持續復制是HBV慢性感染的主要決定因素,HBV共價閉合環狀DNA (HBV cccDNA) 是病毒復制過程中的一種中間形式,每個感染肝細胞平均有5~50拷貝,半壽期為14.5年。HBV cccDNA既能轉錄產生3.5kb前基因組mRNA,又能轉錄出病毒mRNA并翻譯產生包括HBsAg在內的病毒蛋白,是乙肝病毒復制水平最特異的指標,但通過肝活檢來監測患者肝組織中的HBV cccDNA水平在臨床應用上有一定的難度。血清HBV DNA 水平與傳染性和疾病進展密切相關,是病毒復制活動最直接和最可靠的標志,是目前評價HBV 復制情況的“金標準”, HBV DNA檢測是唯一能幫助確診隱匿性HBV感染和隱匿性慢性乙型肝炎的實驗室檢測指標。而HBV DNA定量檢測對血清學非典型的慢性HBV感染者診斷至關重要,對非活動性HBsAg攜帶狀態的判定 (血清HBV DNA<2 000IU/ml) 有重要意義,也是了解HBeAg陰性慢性乙型肝炎病毒復制水平主要指標。


    慢性感染各個時期具有明顯不同的病毒學特征和宿主免疫反應狀態和肝臟病理損傷。HBV DNA實驗室定量檢測有助于確定感染者的狀態,對確定是否開展抗病毒治療及適宜抗病毒治療方案的選擇至關重要。


    免疫耐受期 其主要特征是病毒復制活躍,實驗室檢測感染者外周血有較高載量的HBV DNA,通常高于20,000 IU /mL(1x10^5拷貝/ml,下同),血清學檢測表現為HBsAg和HBeAg陽性,感染者的ALT多正?;騼H有輕微升高,肝臟組織病理學正?;騼H有輕度炎癥反應。


    免疫清除期 實驗室檢測為HBsAg持續陽性,ALT持續升高,也可有間歇升高。外周血HBV DNA持續維持在較高水平,通常高于20,000 IU /mL,或有波動。處于此期的慢性HBV感染者HBeAg多為陽性,HBeAg陽性表明有較高的病毒復制,傳染性較強,可診斷為HBeAg陽性慢性乙型肝炎。非活動性HBsAg攜帶狀態 約有66%或更多的感染者會發生HBeAg血清轉換,實驗室檢測HBsAg持續陽性,但HBeAg消失,抗-HBe陽性,病毒維持低水平復制,外周血病毒載量低于2,000 IU /mL或檢測不到,ALT在正常范圍內,肝活檢無明顯的炎癥反應。再活動期 實驗室檢測ALT間歇升高、肝臟有活動性炎癥反應,血清HBsAg持續陽性,可有抗-HBe陽性,或HBeAg陽性。外周血病毒載量可低于2,000 IU/mL。但如發生pre-C/C區突變,HBeAg表達下調或不表達,此時盡管HBeAg陰性,HBV仍處于高復制狀態,外周血仍可檢測到較高的病毒載量。


    乙肝恢復期 每年約1%非活動性HBsAg攜帶者可自發性清除HBsAg,實驗室檢測血清HBsAg陰性,可有抗-HBc和抗-HBs抗體陽性,血清中檢測不到HBV DNA,稱為乙肝恢復(Resolved Hepatitis B),由于我國慢性HBV感染者多在嬰幼兒時期感染,自然發生乙肝恢復者較為少見。


    隱匿性HBV感染 (Occult HBV infection)血清HBsAg檢測陰性,但外周血或肝組織中可檢測到HBV DNA。


    表1為幫助確定不同感染階段的實驗室檢測指標及意義。

    慢性乙型肝炎、代償期和失代償期肝硬化的5年病死率分別為0%~2%、14%~20%和70%~86%,慢性乙型肝炎所致相關肝臟疾病是HBV感染的主要致死原因,我國每年因HBV感染導致的肝硬化、肝癌死亡達30余萬例。因此,對慢性乙型肝炎應積極進行干預治療。慢性乙型肝炎的總體治療目標是:最大限度地長期抑制或消除HBV,減輕肝細胞炎癥壞死及肝纖維化,延緩和阻止疾病進展,減少和防止肝臟失代償、肝硬化、HCC及其并發癥的發生,從而降低病死率,改善生活質量。慢性乙型肝炎治療主要包括抗病毒、免疫調節、抗炎保肝、抗纖維化和對癥治療,以抗病毒治療最為關鍵??共《局委熤饕ㄟ^長期抑制HBV復制來實現上述目標??共《局委熤饕糜诿庖咔宄诤驮倩顒悠诘幕顒有月砸倚透窝谆颊?。因此,首先需要通過HBV DNA的定量檢測等可靠的實驗室診斷來確定慢性乙型肝炎適宜治療患者及治療時機,并據此確定合適的治療方案。此外,治療過程中通過HBV DNA的定量檢測監測病毒學應答對于判定抗病毒療效、調整臨床抗病毒治療方案及預后等有重要意義。


    目前的治療乙型肝炎的藥物主要是包括兩類:一類為普通干擾素α和聚乙二醇干擾素α,另一類為核苷(酸)類似物。干擾素具有增強免疫和抗病毒作用,通過一定療程可使部分患者獲得較為持久的應答,有研究報道接受長效干擾素治療患者中HBeAg陽性慢性乙型肝炎患者的HBsAg清除率可達到3%~10%?;颊逪BsAg消失或血清轉換的比率高于核苷(酸)類似物,但干擾素類藥物治療存在不良反應,限制了其在臨床的廣泛應用。核苷(酸)類似物通過抑制逆轉錄過程,以抑制病毒復制,抑制病毒作用較強,但短期內不能清除肝細胞內HBV cccDNA,停藥后復發率高。一直認為,核苷(酸) 類似物治療慢性乙型肝炎,HBsAg清除率較低,難以作為治療終點指標,但近年來,隨著臨床抗病毒治療方案的不斷優化和完善,通過持續的核苷 (酸)類似物抗病毒治療,慢性乙型肝炎HBsAg清除率有所提高,部分報道可達6%。


    HBV DNA的定量檢測除用于慢性乙型肝炎的診斷外,患者外周血中HBV DNA載量也是決定是否進行抗病毒治療的重要指標,幾乎各國慢性乙型肝炎防治指南均推薦依據病毒載量確定是否開始抗病毒治療。血清HBV DNA定量是確定患者抗病毒治療適應證的重要指標,對于HBeAg陽性慢性乙型肝炎患者,HBV DNA ≥20 000 IU/mL,且有肝臟活動性炎癥者 (ALT升高,或肝活檢發現肝臟炎癥指數≥G2),即應開展抗病毒治療。HBeAg陰性慢性乙型肝炎患者往往病史較長,病變長期積累,肝硬化年發生率達8%~10%,高于HBeAg陽性慢性乙型肝炎(2%~5%),因此,更應積極開展對HBeAg陰性慢性乙型肝炎的治療,當HBVDNA ≥2 000 IU/mL伴有肝臟活動性炎癥指標時,即應開始抗病毒治療。


    血清HBV DNA水平的下降為判定抗病毒治療效果的重要依據,是基于應答指導的治療 (response-guided therapy) 的重要指標。因此,治療前應有基線水平檢測,一旦開始治療,則應每3~6個月檢測一次,動態監測HBV DNA水平的變化,同時檢測ALT、HBeAg和抗-HBe。核苷(酸)類似物治療線路圖(roadmap)主要依賴HBV DNA的定量檢測確定病毒學應答情況,對判斷療效、預后和耐藥發生至關重要,是對治療方案進行優化和調整的重要依據。如果HBV DNA水平在核苷(酸)類似物治療有效,同一藥物繼續治療;否則為治療失敗應進行聯合治療。其中治療24周時的血清HBV DNA絕對水平若低于60 IU/mL為完全病毒應答,可繼續同一藥物治療;高于60 IU/mL但低于2 000 IU/mL為部分應答,應根據選用的具體藥物確定是否調整。治療24周時患者血清HBV DNA水平高于2 000 IU/mL則為應答不充分。


    三、我國乙型病毒性肝炎診斷試劑的研發


    良好的診斷試劑是通過可靠的實驗室檢測來準確診斷慢性乙型肝炎、開展有效抗病毒治療的前提,這對開展流行病學調查,準確掌握我國HBV感染的流行情況并制定相應的防控措施同樣至關重要?;谖覈倚筒《拘愿窝自\斷試劑的現況及發展需求,我國在中長期科技發展規劃“傳染病防治重大專項”病毒性肝炎領域設置了專門的研究課題,以加強我國乙型肝炎診斷試劑的研發實力,提高國產診斷試劑質量,研發新的定性和定量檢測試劑,滿足乙型病毒性肝炎的診、防、治需求。在“十一五”期間重點開展了現有的乙型/丙型病毒性肝炎酶聯免疫試劑盒和核酸定量檢測試劑盒在特異性、穩定性和靈敏度方面的改善,通過優化現有純化系統及生產工藝,規范生產流程,強化質量控制體系,提高現有的乙型/丙型病毒性肝炎酶聯免疫試劑盒和核酸定定量檢測試劑盒的特異性和靈敏度;利用基于發光技術等高靈敏標記技術和檢測體系,研發靈敏度和特異度更高的定性、定量免疫診斷試劑盒,開展了相應溯源標準物質的研制;依據我國病毒性肝炎流行病學調查結果,開發乙型肝炎病毒基因分型和耐藥變異的檢測試劑盒。近期對這些研發試劑盒的考評顯示,酶聯免疫檢測試劑的質量已有較大提高,定量檢測試劑的線性范圍、檢測下限等已有較大改善。但應看到,在病毒性肝炎實驗室診斷方面,國際上單一診斷試劑的概念已逐漸被全自動、系統化的診斷技術所取代。我國在檢測試劑的全自動系統化方面與國外有較大差距,影響了診斷試劑質量的進一步提高。此外,隨著臨床抗病毒治療和新興免疫治療技術方法的開展,在適宜治療病人篩選、治療效果評價和預后判定等方面對病毒性肝炎實驗室檢測和診斷技術提出了新的需求。因此,在今后的工作中,應加強源頭研發,大力推進擁有自主知識產權的高質量的抗原、抗體等關鍵原材料研制;利用“十一五”的抗病毒治療、自然史轉歸研究等項目的成果,研究能預測病毒性肝炎慢性化、重癥化轉歸相關的生物標志物,開展臨床研究評價;研發基于新型標記技術、體系的全自動檢測系統的研制,通過對現行免疫學篩檢方法風險殘余度分析及輸血感染乙型/丙型肝炎數據分析,研究適合于血站和血漿蛋白制品生產企業的高通量全自動肝炎病毒核酸檢測體系。