• <tbody id="ii9dx"></tbody>
  • <button id="ii9dx"></button>
    <th id="ii9dx"></th>
    <tbody id="ii9dx"><noscript id="ii9dx"></noscript></tbody>

    廣州滴眼液價格交流群

    干眼文獻/普拉洛芬治療苯扎氯銨誘導小鼠干眼的研究

    干眼網 2021-06-26 11:08:25


    作者:何歡 劉祖國 林志榮 劉曉琛 何卉 肖啟國


    【摘要】

    目的 探討普拉洛芬對苯扎氯銨誘導小鼠干眼的治療作用及其可能機制。方法實驗研究。選用BALB/c雄性小鼠70只,使用025 %的苯扎氯銨溶液局部點眼以誘導干眼。在第21天時根據淚膜破裂時問(BUT)、角膜熒光素鈉染色、炎癥指數等參數選擇干眼表現程度相似的眼并隨機分為A、B、C、D四組。A組為空白對照,B、C、D組分別使用01 %玻璃酸鈉滴眼液,01 %玻璃酸鈉滴眼液加01 %氟米龍滴眼液,0.1 %玻璃酸鈉滴眼液加01 %普拉洛芬滴眼液進行治療。治療后第0、1、3、5天進行BUT檢測、角膜上皮熒光素鈉染色,眼表炎癥程度的評估及基礎淚液量的測量。治療結束后取下小鼠眼球,進行HE及過碘酸一希夫(PAS)染色,角蛋白10(K10)免疫熒光標記,以及Westernblot檢測角結膜組織中腫瘤壞死因子僅α(TNF-α)表達水平。對方差齊性的數據采用Tukey顯著性檢驗,對方差非齊性的數據采用Dunnet t檢驗。


    結果 經篩選共36只鼠(72只眼)入選治療實驗,每組18只眼。在使用藥物治療后的第0、1、3天各項臨床指標差異無統計學意義。治療第5天時,A、B、C、D組淚BUT分別為(2.933±0.320)、(2.900±0.280)、(3.464±0.498)和(3.643 4-0.413)S;其中C組與D組的BUT均較A組和B組延長,差異具有統計學意義(F=13.774,P=0.000)。角膜熒光素鈉染色分級A、B、C、D組分別為(11.640 4-1.008)、(11.790±1.188)、(10.330 4-1.371)及(10.270±1.104)分;兩聯合用藥治療組均較人工淚液組和空白對照組角膜熒光素鈉染色分級減輕,具有統計學意義(F=6.145,P=0.001)。角膜炎癥指數評分A、B、C、D組分別為(0.232±0.059)、(0.229 4-0.078)、(0.151±0.055)及(0.154 4-0.056)分;兩聯合用藥治療組均較人工淚液組和空白對照組炎癥指數降低,差異具有統計學意義(F=6.703,P=0.001)。各組間的基礎淚液分泌量差異無統計學意義。HE結果顯示空白對照組上皮厚度高于兩聯合用藥組,聯合用藥組上皮規整;PAS染色示普拉洛芬組及氟米龍組的杯狀細胞數量相當,均多于人工淚液組及空白對照組。普拉洛芬組及氟米龍組的角膜上皮層均幾乎不表達K10,而人工淚液組及空白對照組仍陽性表達。普拉洛芬組及氟米龍處理組角膜中的TNF一僅水平均有下降。結論普拉洛芬具有抑制苯扎氯銨溶液局部點眼誘導干眼眼表炎癥的作用,有望用于干眼眼表炎癥的臨床治療。(中華眼科雜志,2012,48:33-40)


    【關鍵詞】干眼??; 消炎藥,非甾類; 丙酸類; 苯吡喃類; 小鼠; 腫瘤壞死因子a

    干眼是常見的眼表疾病,國外發病率約10%33[1-2],亞洲及我國的發病率可能更高。目前環境污染、生活習慣改變、眼部用藥增加都使干眼的發病率逐漸增高。干眼是一種淚膜和眼表的多因素疾病,能引起眼部不適感、視覺障礙、損壞眼表組織,引起淚膜不穩定,并伴有淚液滲透壓的升高和炎癥反應[3]。既往研究明確了炎癥在干眼的發生發展中起著關鍵的作用。炎癥作為病因,可以觸發眼表炎癥及免疫的循環反應;炎癥可以推動干眼的病程進展,破壞眼表及淚腺組織的結構與功能,破壞淚膜的穩定性,引起惡性循環;炎癥作為結果,使眼部出現紅、癢、干澀甚至導致視力波動。因而抑制炎癥是干眼治療十分重要的措施。目前用于干眼治療的藥物包括糖皮質激素、環孢霉素A、四環素等,但是它們都存在一定不足,如糖皮質激素長期使用可引起高眼壓、黃斑囊樣水腫,環孢霉素A可致局部免疫低下,四環素類全身副作用大等。非甾體類藥物普拉洛芬用于治療眼前節炎癥已有數年,療效較佳且副作用少,但在干眼中是否具有治療效果尚缺乏研究[3-4]。本研究通過建立苯扎氯胺誘導的小鼠干眼模型[6-7],采用隨機對照單盲動物實驗的方法,探討普拉洛芬滴眼液對小鼠干眼的治療效果,為其臨床應用提供一定依據。


    材料和方法


    一、小鼠干眼模型誘導

    健康雄性BALB/c小鼠70只(共140只眼),體重(20±2)g,上海斯萊克實驗動物有限責任公司提供。使用苯扎氯銨溶液滴眼(0.25,每次5μl,2{12,/d)誘導出具有干眼表現的小鼠[7]。小鼠飼養于以下標準環境中:溫度(25 4-1)℃,相對濕度(60±10)。第2天時對小鼠進行干眼臨床評估,包括酚紅棉絲實驗、淚膜破裂時間(breakuptime,BUT)、熒光素鈉染色及角膜炎癥指數(方法見后),將70只小鼠的各項臨床指標進行統計學分析,算成各項臨床指標的均值,選出各項臨床指標在均數±標準差范圍內最接近指標均值的小鼠納人后續治療實驗。


    二、實驗方法

    將入選的小鼠隨機分為A、B、c、D四組,A組為空白對照,B、c、D組分別應用0.1 %玻璃酸鈉(日本參天制藥),0.1 %玻璃酸鈉+0.1%氟米龍(日本參天制藥),0.1 %玻璃酸鈉+0.1 %普拉洛芬(日本千壽制藥)治療,3/d,每次μl。兩藥聯用時,用藥間隔為30 min。在治療后的第0、1、3、5天分別進行Sehirmer I淚液分泌量檢測、BVT、熒光素鈉染色及角膜炎癥指數評分。臨床評估均采用單盲原則。治療結束后,將眼部組織取下,進行相應組織學染色及Western blot蛋白檢測。


    1.淚液分泌量檢測:在每個時間點的同一時段(3PM)使用ZONE-QUICK ?酚紅棉絲(日本Yokota公司)進行Sehirmer I淚液分泌量測試。小鼠腹腔注射戊巴比妥(50 mg/kg體重)全身麻醉后,拉開下瞼,將酚紅棉線折端長1 mm的部分,放置在下瞼接近外眥部的瞼結膜面15 s,測量并記錄棉線變紅部分長度。測試完成后,閉合瞼裂避免過度暴露。


    2.BUT:將1μl的1%的液態熒光素鈉滴至結膜囊并閉合后,裂隙燈顯微鏡(重慶康華公司)鈷藍光下觀察。3次瞬目后,以最后1次瞬目至角膜出現第1個黑斑的時間為BUT。


    3.角膜熒光素鈉染色評分:在滴人熒光素鈉后90 S時,在裂隙燈顯微鏡鈷藍光下進行角膜上皮熒光素鈉染色分級。角膜平均分成4個象限并分別評分,將所有分值相加得到最后分值。評分標準M1:無染色:0分;點狀著色少于30個:1分;多于30個的點狀著色但不彌散:2分;嚴重的彌散染色但無斑塊狀染色:3分;有斑塊狀染色:4分。


    4.角膜炎癥指數:使用裂隙光帶進行角膜炎癥指數評估。炎癥指數由3部分組成[8]:睫狀充血(無充血:0分;有充血帶但寬度小于1 mm:1分;充血帶寬度大于2 mm:3分);中央角膜水腫(無水腫:0分;輕度水腫,虹膜紋理仍清晰:1分;中度水腫,虹膜紋理不清:2分;虹膜及瞳孔不可見:3分);周邊角膜水腫(評分標準同中央角膜水腫)。最終的角膜炎癥指數為3部分評分總和除以9。


    5.組織染色:組織取下后,4%多聚甲醛固定后分別進行石蠟及OCT包埋。小鼠眼部組織(含完整上下眼瞼及瞼球結膜)的石蠟切片行PAS染色,以胞質染色深紅者為結膜杯狀細胞,每眼取6張不同等分位置的切片分別計數,取其平均值為該眼的杯狀細胞數量。OCT包埋標本行冰凍切片的HE及間接免疫熒光染色,一抗為K10抗體(1:400,美國abcam公司),熒光二抗為AlexaFluor488(1:1000,美國Invitrogen公司),使用DAPI(美國Vector公司)復染熒光標本中的細胞核,在激光共焦顯微鏡中觀察并拍照(Fluoview 1000,日本Olympus公司)。


    6.Western blot:分別在各組隨機選取6只眼,取下相應角膜、結膜組織,置于無RNA酶Eppendorf管內,-80℃深低溫冰箱保存。以變性Western blot方法分別檢測分析標本中角膜及結膜組織中TNF一僅蛋白的含量,內參為β-actin。TNF-α僅抗體(1:500,美國Abcam公司),β-actin抗體(1:10000,美國Invitrogen公司)。BIO-RAD凝膠成像系統(美國Bio—Rad公司)顯色,用凝膠分析軟件Quantity One(V4.3.0.002)對條帶密度及面積等參數進行定量分析。


    三、統計學分析方法

    使用SPSS 13.0統計軟件包進行數據分析。描述性統計值用平均值+標準差表示。對干眼臨床指標及TNF.儀表達水平的相關結果,在滿足方差齊性時,采用Tukey顯著性檢驗進行多重比較;方差非齊時,則采用Dunnet t檢驗。以P<0.05作為差異有統計學意義。


    結 果


    一、小鼠干眼模型誘導結果

    經對70只小鼠各項臨床指標進行統計學分析,我們將各項臨床指標在均數±標準差范圍內最接近指標均值的小鼠共36只(72只眼)入選治療實驗,并隨機分人A、B、C、D四組,每組18只眼。統計學分析顯示,A、B、C、D組在治療開始前的BUT,角膜上皮熒光素鈉染色評分、淚液分泌量和眼表炎癥評分的差異均無統計學意義(P值均大于0.05)(1)。


    二、臨床指標的變化

    1.淚膜穩定性的變化:用藥后第0、1、3天,A、B、C、D四組的BUT差異均無統計學意義。用藥第5天,方差分析示各組間差異有統計學意義(F=13.77,P=0.000)。其中A組與B組之間差異無統計學意義(P=0.995)。A組與C組及D組之間差異有統計學意義(P=0.003及P=0.000),B組也與C組及D組之間差異具有統計學意義(P=0.001,P=0.000),C組與D組之間差異無統計學意義(P=0.611)。上述結果提示聯合使用抗炎藥物時,BUT較單用玻璃酸鈉或不用藥物治療時明顯延長,且普拉洛芬的此種作用與氟米龍相當(圖1,表1)。



    2.角膜上皮熒光素鈉染色情況:用藥后第0、1、3天,A、B、C、D四組的角膜上皮熒光素鈉染色評分差異均無統計學意義。用藥第5天,方差分析示各組間差異有統計學意義(F=6.15,P=0.001)。其中A組與B組之間差異無統計學意義(P=0.988)。A組與C組及D組之間差異有統計學意義(P=0.032.0.028),B組與C組及D組之間差異具有統計學意義(P=0.014,0.012),C組與D組之間差異無統計學意義(P=0.999)。上述結果提示聯合使用抗炎藥物時,角膜上皮熒光素著染情況較單用玻璃酸鈉或不用藥物治療時減輕(圖2,表1),且普拉洛芬的此種作用與氟米龍相當。角膜熒光素染色的代表性圖片見圖3。


    3.角膜炎癥指數情況:用藥后第0、1、3天,A、B、c、D四組的角膜上皮熒光素鈉染色評分均無統計學差異。用藥第5天,方差分析示各組間差異有統計學意義(F=6.703,P=0.001)。其中A組與B組之間差異無統計學意義(P=1.000)。A組與c組及D組之間差異有統計學意義(P=0.013,P=0.020),B組與c組及D組之間差異具有統計學意義(P=0.024,P=0.037),C組與D組之間差異無統計學意義(P=1.000)。上述結果提示使用玻璃酸鈉聯合抗炎藥物時,角膜炎癥程度較單用玻璃酸鈉或不用藥物治療時明顯減輕,且普拉洛芬的此種作用與氟米龍相當(圖4,表1)。


    4.淚液量的改變:用藥后第0、1、3、5天,A、B、C、D四組的淚液分泌量均無統計學差異(P=0.163,0.210,0.496,0.697)(圖5)。5.HE染色結果分析:光鏡下觀察角膜、結膜及淚腺組織結構的變化。用藥5 d后,A組角膜上皮細胞形態不規則,愈合欠佳,細胞層數異常增多;


    B組細胞層數雖接近正常水平,但上皮表面凹凸不平,c組和D組角膜上皮層的層數及形態均接近正常(圖6)。提示使用玻璃酸鈉聯合抗炎藥物治療時,角膜上皮的修復情況較單用玻璃酸鈉或不用藥童物治療時為佳,且普拉洛芬的此種作用與氟米龍簍相當。




    6.結膜PAS染色結果:用藥第5天時,A、B、C、D組結膜杯狀細胞數量分別為(71.63±13.71)、(44.68±25.67)、(61.75±18.72)和(58.83±19.21)個。方差分析顯示各組杯狀細胞數量之間差異有統計學意義(F=93.85,P<0.01)。其中A組與B組之間差異具有統計學意義(P=0.000),提示玻璃酸鈉治療時杯狀細胞數量有所恢復。C組與B組、D組與B組之間差異均具有統計學意義(P值分別為0.001及0.008),而c組與D組之間差異無統計學意義(P=0.081)。提示玻璃酸鈉聯合抗炎藥物治療較單用玻璃酸鈉能更好地恢復結膜杯狀細胞數量,且普拉洛芬的此種作用與氟米龍相當(圖7,8)。


    7.角膜、結膜TNF-α的表達水平:治療5 d后,氟米龍組及普拉洛芬組角膜TNF—α的表達水平低于空白對照組及玻璃酸鈉組,差異具有統計學意義(F=6.00,P<0.01)。而各組結膜TNF-α的表達水平未見明顯差異(圖9~11)。


    8.各組K10免疫熒光染色結果:玻璃酸鈉聯合氟米龍或普拉洛芬用藥時,角膜上皮層KIO的表達比單用玻璃酸鈉或不用玻璃酸鈉時表達明顯減弱(圖12)。各組結膜上K10表達未見明顯差異。



    討 論


    眼表、淚腺和中樞神經形成一個功能整體,可以提供適當的反饋機制維持眼表的濕潤。而干眼患者淚液滲透壓的升高會激活眼表的炎癥反應,炎癥通過降低角膜的敏感度,抑制這種正常的反饋機制。炎癥激活后,眼表上皮細胞產生大量的炎癥因子和促炎因子,如TNF-α、IL一1β、MMPs等,誘導巨噬細胞、中性粒細胞浸潤,激活眼表抗原提成細胞,誘導淋巴細胞浸潤,進一步啟動眼表炎癥免疫反應,促進更多的炎癥因子釋放和炎癥細胞的浸潤,形成惡性循環[9]。炎癥發展的不同階段,對眼表功能單位都會有不同程度的損壞,主要表現為[10-11]:淚膜穩定性的降低,眼表上皮的損害,眼表上皮鱗狀化生,淚腺功能障礙等。炎癥因子導致的淚液高滲,炎癥誘導的杯狀細胞的破壞及凋亡,以及黏蛋白的減少等都會導致淚膜的不穩定。炎癥因子還可以促使眼表上皮高表達角化蛋白[12]。因而炎癥是干眼發病的重要環節,抑制眼表炎癥是干眼治療的關鍵措施之一。


    苯扎氯銨滴眼誘導的小鼠干眼中,存在淚膜破壞、上皮損害、炎癥因子TNF-α升高等明顯的眼表炎癥反應,并存在結膜杯狀細胞及角膜上皮鱗化生等干眼的病理改變[13]。我們應用人工淚液聯合普拉洛芬對其進行抗炎治療,并與單用人工淚液進行對比。本研究結果顯示,與未使用藥物治療及單用人工淚液治療的組別相比,接受人工淚液聯合普拉洛芬治療的小鼠,其BUT延長、角膜上皮熒光素鈉染色程度減輕、眼表炎癥減輕;其角膜上皮表面平整,角膜上皮細胞層數接近正常,結膜杯狀細胞數量亦接近正常小鼠,而未治療組及單用人工淚液組的小鼠角膜上皮表面欠平整,局部角膜上皮細胞存在異常增殖或缺損,結膜杯狀細胞數量也明顯減少。免疫熒光染色顯示,未治療組及單用人工淚液組的小鼠角膜上皮仍高表達K1O,而普拉洛芬治療的小鼠角膜上皮幾乎不表達K1O。提示抗炎治療可能抑制或逆轉鱗狀上皮化生。普拉洛芬治療組的小鼠角膜組織TNF-α表達水平下調.證明普拉洛芬可以抑制苯扎氯銨誘導的眼表炎癥反應。


    普拉洛芬抑制干眼眼表炎癥的機制是多方面的。炎癥發生時,細胞膜及部分細胞器的磷脂層在磷脂酶A2催化下生成花生四烯酸,環氧化酶(cycloxygenase,COX)使其分解生成前列腺素E2、前列腺素D2、血栓素等,這些產物可以擴張血管、增加血管通透性,并進一步誘導炎癥反應。普拉洛芬屬丙酸類非甾體抗炎藥,通過非選擇性抑制環氧化酶,抑制花生四烯酸生成前列環素、前列腺素和血栓素等,進而改變粒細胞與T淋巴細胞反應,降低粒細胞與單核細胞的遷移與吞噬作用[14],從而達到抑制炎癥的作用。同時,非甾體類抗炎藥物還可通過影響T淋巴細胞的激活,調節白細胞介素-2,干擾素-γ和TNF-α的生成[15]。我們的研究已證明普拉洛芬可以減少干眼動物模型眼表TNF—α的表達。


    既往研究表明減少炎癥因子TNF一α,可以抑制炎癥信號通路及抗原提呈細胞的激活,減少對淋巴細胞及其他炎癥細胞的誘導,并可抑制細胞凋亡,減少對杯狀細胞及淚腺腺管細胞的損害,增加淚膜中的黏蛋白、表皮生長因子等,有利于淚膜功能恢復[16]。抑制TNF-α還可以減少COX-2的表達[17],這可能是普拉洛芬抑制眼表炎癥的另一機制。但更詳細的機制還需要進一步研究闡明。


    各類文獻表示普拉洛芬同時涉及對COX-1的抑制作用,它的使用具有一定局限性。雖有報道[4-5]其他類型的非甾體類抗炎藥物,在長期局部點眼后會出現角膜敏感性下降、上皮缺損及潰瘍穿孔等并發癥,但此類并發癥發生率較低,且關于普拉洛芬的副作用不暫未存在此類報道。故使用普拉洛芬治療干眼,較皮質類固醇激素更安全,但仍需注意其適應證及應用時間,并需密切觀察。


    本實驗中各治療組間淚液分泌量并無差異,可能與所用藥物均無促進淚液分泌功能有關[18-19];各組的小鼠結膜組織中TNF-d表達水平未見明顯差異,推測可能是小鼠結膜所占眼表面積比例較小,苯扎氯銨誘導的眼表炎癥反應主要存在于角膜的緣故。


    綜上所述,本研究證實了普拉洛芬具有抑制苯扎氯銨誘導小鼠干眼眼表炎癥,促進淚膜恢復的作用,對治療中重度干眼的眼表炎癥有一定指導作用。







    參考文獻


    [1]Schaumberg DA,Dana R,Buring JE,etal Prevalence of dry eye

    disease among US men:estimates from the Physicians’Health

    Studies Arch Ophthalm01.2009.127:763-768.


    [2]Schaumberg DA,Sullivan DA,Buring JE,et al Prevalence of

    dry eye syndrome among US women Am J Ophthalmol,2003.

    136-318-326.


    [3]Lemp MA,Baudouin C.Baum J.et al ne definition and

    classification of dry eye disease:Report of the Definition and

    Classification Subcommittee of the international Dry Eye WorkShop(2007).Ocul Surf,2007,5:75-92.


    [4]Aragona P.Stilo A.Ferreri F,et a1.Effects of the topical

    treatment with NSAIDs on corneal sensitivity and ocular surface of

    Sjogren’s syndrome patients .Eye(Lond),2005,19:535-539.


    [5]Isawi H,Dhaliwal Dk. Corneal melting and perforation in Stevens Johnson syndrome following topical bromfenac use. J Cataract Refract Surg,2007,33:1644-1646.


    [6]Pauly A,Brignole—Baudouin F,Labbe A,et al. New tools for the evaluation of toxicocular surface changes in the ral. Invest Ophthalmol Vis Sci.2007,48:5473-5483.


    [7]Xiong c,Chen D,Liu J,et al. A rabbit dry eye model induced by topical medication of a preservative benzalkonium hloride.Invest Ophthalmol Vis Sci,2008,49:1850-1856.


    [8]Zhang z,Ma JX,Gao G,et al.Plasminogen kdngle 5 inhibits alkali-burn-induced corneal neovascularization Invest Ophthalmol Vis Sci.2005,46:4062-407l.


    [9]Mccabe E,Narayanan S.Advancements in anti—inflammatory therapy for dry eye syndrome Optometry,2009,80:555-566.


    [10]Baudouin C The pathology of dry eye.Surv Ophthalmol,2001,45 Suppl 2:S211-220.


    [11]Argueso P,Balaram M,Spurr-Michaud S.et a1.Decreased levels of the goblet cell mucin MUC5AC in teats of patients with Sjogren syndrome.Invest Ophthalmol Vis Sci.2002,43:1004-10ll.


    [12]Ghen YT,u S.Nikulina K,et al.Immune profile of squamous metaplasia development in autoimmune regulatordeficient

    dry eye.Mol Vis,2009,15:563-576.


    [13]Lin Z,Liu X,Zhou T,et al. A mouse dry eye mode induced by topical administration of benzalkonium chloride.Mol Vis,20l1,17:257-264.


    [14]Kim SJ,Finch A2,Jampol LM. Nonsteroidal anti-inflammatory

    drugs in ophthalmology. Surv Ophthalmol.2010,55:108-133.


    [15]Iniguez MA, Punzon c,Caeheiro-Llaguno C,et al.Cyclooxygenase-independent inhibitory effects on T cell activation of novel 4,5-dihydro-3 trifluoromethyl pyrazole eyelooxygenase-2 inhibitors. Int lmmunopharmacol.2010,10:1295-1304.


    [16]Luo L,Li DQ, Doshi A,et al. Experimental dry eye stimulates production of inflammatory eytokines and MMP-9 and activates

    MAPK signaling pathways on the 0cular surface. Invest Ophthalmol Vis Sci,2004,45:4293-4301.


    [17]Takahashi S,Shigeta J,Inoue H,et al. Localization of eyelooxygensae-2 and regulation of its mRNA expression in gastric

    ulcers in rats.Am J Physiol,1998,275:1137-1145.


    [18]Lekhanont K,Park CY,Smith JA.el al Effects of topical anti-inflammatory agents in a botulinum toxin B—induced mouse model of keratoconjunctivitis sicca. J Ocul Pharmacol Ther,2007,23:27-34.


    [19]Avunduk AM,Avunduk MC,Varnell ED,el al. The comparison

    of efficacies of topical cortieosteroids and nonstemidal anti-

    inflammatory drops oil dry eye patients:a clinical and immunoeytochemical study. Am J Ophthalmol,2003,136:593—

    602.


    溫馨提示:可登陸干眼網、醫信眼科網站查看PDF版本文獻。



    Copyright ? 廣州滴眼液價格交流群@2017